ABSTRACT
Giardia intestinalis (G. intestinalis) é o parasita gastrointestinal mais comum que coloniza o trato intestinal humano onde permanece extracelular e aderido às células intestinais. O parasita tem uma distribuição mundial, causando um número estimado de 2.8x108 casos por ano e recentemente a doença foi incluída como parte da Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial de Saúde. As manifestações clínicas da giardíase são variáveis, e vão desde a ausência de sintomas até diarreias agudas ou crônicas. Adicionalmente, estudos recentes indicam que distúrbios gastrintestinais funcionais, tais como a síndrome do intestino irritável, e o déficit de crescimento em crianças podem ser associados com a infecção por G. intestinalis. Apesar da alta prevalência e das consequências desta doença, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes na giardíase ainda permanecem incompreendidos. Os trofozoítos causam a doença sem penetrar no epitélio intestinal, nem entrar na corrente sanguínea e sem secretar nenhuma toxina conhecida. Nos últimos anos, tem sido descrito que as vesículas extracelulares podem participar na interação parasita-célula hospedeira. As vesículas extracelulares podem ser: microvesículas (MVs) e derivadas da membrana plasmática; exosomos, pequenas vesículas originadas a partir de membranas de endossomos; e corpos apoptóticos contendo material do núcleo celular. As MVs têm sido mostradas como importantes fatores na interação parasita-célula hospedeiraNo presente trabalho, foi utilizada uma combinação de metodologias, incluindo citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, proliferação celular, análises de proteoma e ensaios de aderência celular para investigar o papel das microvesículas liberadas por trofozoítos de G. intestinalis nas propriedades patogênicas deste parasita.
Demonstramos que G. intestinalis produz e secreta microvesículas com exposição superficial de fosfatidilserina. Além disso, o processo de liberação de MVs é dependente do tempo e da concentração de cálcio, envolve microdomínios de membrana e as microvesículas contêm RNA de baixo peso molecular. Observamos também que os microdomínios de membrana estão envolvidos na adesão do parasita à células Caco-2. Nossa análise proteômica preliminar sugere presença de componentes do citoesqueleto, alfa giardinas, enzimas metabólicas e proteínas variáveis de xi superfície (VSP) nas MVs isoladas de G. intestinalis. Foi demonstrado também que as MVs de G. intestinalis interagem com as células do hospedeiro aumentando a proliferação destas e incrementado também o número de trofozóitos aderidas à estas células. O presente estudo é o primeiro a sugerir um papel potencial para as microvesículas de G. intestinalis na colonização do hospedeiro. Uma melhor compreensão do papel das MVs liberadas pelo parasita na interação com a célula hospedeira poderá fornecer novas perspectivas sobre patogênese e possivelmente novas ferramentas para o diagnóstico e a terapia da doença.
Giardia intestinalis (G. intestinalis) is the most common gastrointestinal parasite thatcolonizes the human intestinal tract where it remains extracellular and adheres to intestinalcells. The parasite has a global distribution causing an estimated 2.8x108cases per year andthe illness was recently included in the World Health Organization Neglected DiseaseInitiative. Clinical manifestations of giardiasis are quite variable, and range from the absenceof symptoms to acute or chronic diarrhea. Aditionally, recent studies indicate that functionalgastrointestinal disorders, such as irritable bowel syndrome, and failure of children to thrivecan be associated with G. intestinalis infection. Even though the high prevalence andconsequences of this disease, pathophysiological mechanisms underlying symptomaticgiardiasis remain incompletely understood. Trophozoites cause disease without penetratingthe intestinal epithelium, entering the bloodstream or secreting toxins. In recent years it hasbeen described that extracellular vesicles could participate in parasite-host cell interaction.The extracellular vesicles may be: microvesicles (MVs) and derived from the plasmamembrane; exosomes, small vesicles originated from endosomal limiting membrane; andapoptotic bodies containing nuclear material. MVs have been shown to be important factors inthe parasite-host cell interaction. Here, we used a combination of methodologies includingflow cytometry, fluorescence microscopy, cell proliferation, proteomics analysis and celladherence assays to investigate the role of released microvesicles from G. intestinalistrophozoites on the pathogenic properties of this parasite.
We have found that G. intestinalisproduces and secretes microvesicles with superficial exposition of phosphatidilserine.Additionally, the shedding process was calcium and time-dependent, involves membranemicrodomains and the microvesicles contain low-molecular weight RNA. We also observedthat membrane microdomains are involved in parasite attachment to Caco-2 cells. Ourpreliminary proteomic analysis suggested the presence of cytoskeleton components, alphagiardins, metabolic enzymes and variant-specific surface protein (VSP) in the isolated MVsfrom G. intestinalis. We demonstrate that G. intestinalis microvesicles interact with host cellsxiiiincreasing their proliferation and augmenting the number of trophozoites adhered to thesecells. The present study is the first to suggest a potential role for G. intestinalis microvesiclesin host cell colonization. A better understanding of the role of the released microvesicles bythe parasite on the host-cell interaction will provide insights into pathogenesis and possiblynew tools for diagnosis and therapy.